Endotoxin szennyeződés megelőzése és eltávolítása

A Gram-negatív baktériumok sejthártyáját felépítő endotoxinok jelen vannak környezetünk szinte minden vizes oldatában, a levegőben sőt még gyógyszereinkben is. Minthogy az endotoxin rendkívül veszélyes az emberi szervezetre, nagyon fontos az endotoxin szennyeződés minimális értékre történő csökkentése, vagy ha lehetséges, a teljes kizárása, különös tekintettel az orvosi, a biotechnológiai és a gyógyszeripari termékekben.

A legbiztonságosabb megoldás az endotoxin szennyezés megelőzésére az abszolút steril körülmények megteremtése a gyártási folyamat minden egyes lépésében. Ez azonban csak elméletileg lehetséges. A szennyeződés forrásai lehetnek a felhasznált nyersanyagok (sók, víz, szérumok stb.), pufferek, oldószerek, a tisztítási eljárásokban használt eszközök és maga a gyártási eljárás is (pl. baktériumok felhasználása a gyártás során).

A levegő és a víz pirogénmentesítése viszonylag egyszerű folyamat. Szűrésük a kereskedelemben kapható molekulaszűrők segítségével elvégezhető. A víz szűrésére általában pozitívan töltött felületű molekulaszűrőt alkalmaznak, hiszen a Gram-negatív baktériumokról leváló, negatív töltést hordozó endotoxin így a szűrő mátrixához kötődik. Az így előállított ultratiszta víz elengedhetetlen az olyan eljárások során, ahol az endotoxin jelenléte szigorúan korlátozott (pl. az emberi vér dialízise). Érdemes azonban megjegyezni, hogy a hőmérséklet vagy a pH érték változásának hatására az endotoxin molekulák degradálódhatnak és a legtoxikusabb rész, a lipid A átjuthat a szűrőrendszeren!
Az ultraszűrés és a 'size exclusion' kromatográfia azonban nem alkalmazható fehérjeoldatok esetében. Az idevonatkozó irodalomban és a benyújtott szabadalmakban sok módszert ismertetnek az endotoxin eltávolítására, azonban egyik sem alkalmazható széles körben. A kutatóknak szembesülniük kell a következő problémákkal: heterogén kémiai struktúra, eltérő molekulasúly, protein-endotoxin kölcsönhatás stb.
Az endotoxin (LPS) kémiai szerkezete a gazdabaktériumtól függően változó. Mind a poliszacharid-lánc, mind pedig a lipid A összetétele nagy variációkat mutat. Ezért rendkívül nehéz olyan módszerek kidolgozása (IgG, IgM antitestek, affinitáskromatográfia stb.), melyek (függetlenül az LPS típusától) nagy biztonsággal eltávolíthatnák az endotoxin szennyeződést az adott termékből.
Tovább nehezíti a kutatók dolgát, hogy a kémiai szerkezet függvényében az endotoxin molekulasúlya is változó. A molekulasúly változásának oka lehet, hogy az endotoxin molekulák vizes oldatban spontán összetapadhatnak a lipid A-n keresztül, továbbá az acil-láncokon keresztül nem-poláros kölcsönhatások is kialakulhatnak a szomszédos molekulákkal. A kétértékű kationok (Ca, Mg) a foszfát csoportok között hídkötéseket alakíthatnak ki, ezáltal aggregátumokat képezhetnek és micelláris struktúrát alkothatnak. A kialakult aggregátumok molekulasúlya elérheti az 1 MDa-t is, szemben a 10-20 kDa-os monomer molekulasúlyával. Nagy koncentrátum esetén vezikulák (r=100 nm) is létrejöhetnek, amelyek nagyon stabil képződmények.
(Az aggregátumok és micellák kialakulása megelőzhető detergensek (pl. Triton X-114), epesavak (pl. deoxychlolic acid) vagy kelátorok (pl. EDTA) adagolásával.)
Habár a nagyméretű endotoxin egységek eltávolíthatók (precipitáció, ultraszűrés vagy kromatográfiás technikák segítségével), a kisebb egységek (monomerek, dimerek, fragmentumok) az oldatban maradnak. Ez az alacsony, de biológiailag továbbra is igen aktív koncentrációjú endotoxin elválasztása a proteinektől nagy nehézséget okoz.

A vázolt problémák ellenére vannak ígéretes megoldások (kationos polimerek, affinitás membránok), azonban a használni kívánt eljárást a legtöbb esetben a saját igényeinkhez kell igazítani.