LAL mérési módszerek

Az endotoxin közvetlen mennyiségi mérése jelenleg még nem megoldott, ezért több, az endotoxin hatásán alapuló, az FDA által is jóváhagyott, közvetett mérési módszer került bevezetésre.

Pirogén teszt

Ma már alig használt, az endotoxin lázkeltő hatásán alapuló módszer. A vizsgálandó anyagot a nyúl vérébe juttatva, a testhőmérséklet emelkedéséből meghatározható a vizsgálandó anyag endotoxin tartalma.

Hátrányai:

• Érzékenysége korlátozott
• Specifikussága korlátozott
• Monitorozásra nem alkalmas
• Időigényes
• Alkalmazása etikai problémákba ütközik

Gél-képződésen alapuló módszer

A tesztelés során a tesztoldatot és a lizátumot aszeptikusan összekeverik, majd a megfelelő körülmények mellett meghatározott időtartamig közvetlenül inkubálják. A minták hígítási sorát hasonlítják össze az ismert koncentrációjú endotoxin hígítási sorával (standard-sor). Hibalehetősége: 1-2-szeres hígítás. Érzékenysége: 0,03 EU/mL.

Előnye:

• Nem igényel műszerezettséget

Hátrányai:

• Szemi-kvantitatív
• Bizonytalan (a gél szerkezete keresztkötések hiányában labilis)
• Pontatlan
• Szubjektív
• Érzékenysége korlátozott
• Monitorozásra nem alkalmas
• Betanítást igényel

Turbidimetriás kinetikus módszer

Az endotoxin a lizátumban lévő proenzim aktiválása révén gélképződést índít, ahol az aktiváció kezdeti sebességét a jelenlévő endotoxin koncentrációja határozza meg. A gélképződés során az oldat turbiditása folyamatosan növekszik, amely spektrofotométer segítségével követhető (360, 405 vagy 565 nm). Érzékenysége: 0.001-100 EU/ml. Rendkívül érzékeny módszer, azonban a jel/zaj viszony aránya közel egy nagyságrenddel kisebb, mint a kromogén módszer esetén. Nagy pontosságú mérések esetén a kromogén peptid módszerek a javasoltak.

Kromogén peptid végpontos módszer

A reakció mechanizmusa megegyezik a kinetikus módszernél ismertetettel. A pNA kiválást fotometriásan 405-410 nm-en mérik, azt követően hogy a reakciót stopreagenssel (pl. ecetsav) leállították. A színintezitás és az endotoxin koncentráció közötti korreláció a 0.01-1.0 EU/ml tartományban lineáris. A vizsgálandó mintában lévő endotoxin koncentrációt az adott mennyiségű standard endotoxint tartalmazó oldatok abszorbciós értékéből számítják ki.

Kromogén peptid kinetikus módszer

Az endotoxin-lizátum komplex, sárga színű para-nitroanalin festéket (pNA) szabadít fel egy mesterségesen előállított szintelen peptid szubsztrátumból. A színreakción alapuló kinetikus módszer esetén a pNA kiválást fotometriásan az egész inkubációs periódus alatt folyamatosan 405 nm-en mérik. A meghatározott optikai sűrűség eléréséhez szükséges idő (reakcióidő) és az endotoxin koncentráció közötti korreláció 0.005-50 EU/ml-ig lineáris. Az endotoxin koncentrációját a reakcióidőből számítják ki oly módon, hogy ismert mennyiségű standard endotoxint tartalmazó oldatok reakcióidejével vetik egybe.

A kinetikus módszerek

Előnyei:

• Kvantitatív
• Pontos
• Megbízható
• Érzékeny
• Monitorozásra alkalmas

Hátrányai:

• Műszerezettséget igényel
• Betanítást igényel