Az endotoxin mérés alapjai

A múltban az endotoxin kimutatására a "nyúl tesztet" alkalmazták. A nyulat beoltva a vizsgálandó mintával, figyelték a nyúl testhőmérsékletének változását. Lázas reakció esetén a minta endotoxint tartalmazott. Ennek a módszernek több hátránya is van. Az anyagi és etikai kérdéseken túl a módszer nagyon időigényes és nem kvantitatív. Pontosabb mérések szükségessége esetén a módszer érzékenysége, pontossága és reprodukálhatósága sem kielégítő.

A parenterális készítmények és gyógyászati eszközök pirogén-szennyezettsége megállapításának legelterjedtebb módszere a patkórákból kivont Limulus Amoebocyte Lysate-re (LAL) alapozott mérés, mivel ez a legérzékenyebb, reprodukálható és gazdaságos eljárás, amellyel meghatározható a Gram-negatív bakteriális eredetű endotoxin (pirogén). Ez a rendkívül érzékeny teszt kezdetben is különösen hasznosnak bizonyult olyan termékek pirogén vizsgálatára, amelyeket a nyulakon nehezen lehetett tesztelni (pl. intrathekális injekciók, radioaktív gyógyszerek, rákgyógyászati szerek és bizonyos biológiai készítmények).

A patkórák, tudományos nevén Limulus polyphemus, közeli rokona a pókoknak. E különös tengeri élőlény négy fajtája élte túl az elmúlt 500 millió évet. Jelenleg az USA keleti és Ázsia délkeleti partjainál fordulnak elő legnagyobb számban.
A patkórák az óceánban él társközösségben a Gram-negatív baktériumokkal. Az embertől eltérően a keringési rendszere nyitott, ahol a vér direkt kontaktusban áll a szövetekkel. A páncélzat repedésén át bekerülő baktériumok így pillanatok alatt eljuthatnak a szervezet minden pontjához. (Az ember esetében több ezer kilométer hosszú véredény rendszer szállítja a vért a kapilláris hálózatokon keresztül a szövetekhez.) Ezért a patkórák egy rendkívül szenzitív védelmi rendszert fejlesztett ki, amely képes felismerni a baktériumok jelenlétét a lipopoliszacharidjukon (LPS) keresztül. A védelmi rendszer katonái a vérsejtek (amőbaciták). Normális esetben ezek végzik a szokásos vérsejtekhez kapcsolódó feladatokat (elnyelik az idegen vagy az elpusztult sejteket, szállítják és tárolják a megemésztett anyagokat, helyrehozzák a sérüléseket stb.). Ezek a sejtek ovális alakúak és kis szemcsékbe szerveződnek. Ezek a szemcsék tartalmazzák az alvadási faktort (koaguláns), amit a baktérium érzékelése esetén kibocsátanak a környezetükbe. Ezek a koagulánsok, reakcióba lépve az LPS-sel, nagyon rövid idő alatt megalvasztják a környező folyadékot, ezáltal csapdába ejtik a behatoló baktériumot. Ezek a megalvadt részek annyira stabilak, hogy még a csapdába ejtett baktérium Brown-féle mozgását is megakadályozzák.

A patkórákok ezen képességét használják ki az endotoxin mérések kivitelezésekor. A Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) reagenst a patkórákok véréből nyerik. A vérvétel után a patkórákokat 24 órán belül visszaengedik az óceánba, ahol teljesen felépülnek. A vér a folyékony szérum és a szuszpendált amőbaciták keveréke. Centrifugálással a két összetevő elkülöníthető. A cső alján összegyűlt pelletet átmossák, szuszpendálják és összegyűjtik. Az összegyűjtött vérsejteket desztillált vízzel keverik, így a vérsejtek friss vizet abszorbeálnak és híznak egészen addig, amíg szét nem robbannak. A folyamat eredményeként a koaguláns oldatba kerül. Az oldatot szűrik, eltávolítják a sejttörmelékeket, majd -80 °C -on szárítják. A folyamat végén kinyert fehér porszerű anyag a LAL, amelyet az endotoxin mérésekhez használnak, mint reagenst.

A LAL az endotoxinnal reakcióba lépve masszív gélképződést, megnövekedett viszkozitást és opaleszkálást vált ki. A koagulációs folyamatot az endotoxin hatására fellépő reakciók láncolata építi fel. Ez a több lépéses reakció teszi rendkívül érzékennyé a LAL rendszert, hiszen egymást erősítő folyamatok láncolatából áll.

A mintában lévő endotoxin mennyiségi meghatározására a gél-képződésen és a színreakción alapuló LAL-méréseket használják. Mindkét esetben lehetőség van végpontos és kinetikus mérésre is.

A gél-képződésen alapuló mérés mechanizmusa egy endotoxin által indukált katalitikus folyamat, amelyben az aktivált enzim (koaguláz) specifikus kötéseket hidrolizál a koagulogén fehérjében. A hidrolizált kötéseket tartalmazó koagulin fehérjék összekapcsolódnak és gélformában kialakuló alvadékot képeznek. Az aktiváció kezdeti sebességét az endotoxin koncentrációja határozza meg.
- A kvantitatív színreakción alapuló meghatározás során egy endotoxin által aktivált enzim para-nitroanilint (pNA) szabadít fel egy színtelen, szintetikus szubsztrátból (Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA), sárga elszíneződés kíséretében. A pNA kiválást fotometriásan 405 nm-en mérik. A színintenzitás és az endotoxin-koncentráció közötti korreláció, kinetikus méréstechnika alkalmazása esetén a 0,005-50,0 EU/ml tartományban lineáris (végpontos technika esetén ez az érték 0,01-1,0 EU/ml).

A LAL méréseket a cégünk által kifejlesztett, korszerű, megbízható és validált eszközökkel valamint a PyroSolution program segítségével végezhetjük el.

A mérésekhez alkalmazott folyamat rövid leírása:

• endotoxin standard sor előállítása
• a minták előkészítése
• a mikrolemez feltöltése
• a mérőprogram és a fotométer konfigurálása
• a mikrolemez-kinetikus mérés elindítása
• a nyers adatok kvalifikálása
• az eredmények kiértékelése
• a riportok nyomtatása
• az eredmények jóváhagyása
• archiválás
• az eredmények kiküldése

Ez az eljárás - és a hozzátartozó metodika - megfelel az európai és az amerikai gyógyszerhatóságok előírásainak és a WHO követelményeinek.

A LAL mérések felhasználási területei:

• hemodialízisben használt oldatok vizsgálata
• orvosi segédeszközök vizsgálata
• infúziós oldatok vizsgálata
• injekciók vizsgálata
• táptalaj vizsgálata
• vérkészítmények vizsgálata
• biológiai élelmiszer vizsgálata
• környezetvédelmi minták vizsgálata
• víztisztító rendszerek és berendezések monitorozása
• diagnosztikai vizsgálatok
• állategészségügyi minták vizsgálata